本发明涉及称为DivIB的抗原多肽及其变体、包含所述多肽的疫苗和所述疫苗在保护受试者免受微生物感染中的用途。
1.一种多肽,其选自:i)由SEQxa0IDxa0NO:3所示的核苷酸序列编码的多肽;ii)由核苷酸序列编码的多肽,其中所述序列由于遗传密码而与(i)中定义的核苷酸序列简并;iii)由SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列组成的多肽,其中所述多肽用作疫苗。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由SEQxa0IDxa0NO:3所示的核苷酸序列编码。
3.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽由SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列表示。
4.一种核酸分子,其编码用作疫苗的根据权利要求1-3的任一项所述的多肽。
5.一种用于抗金黄色葡萄球菌感染而接种的疫苗组合物,其包含选自下列多肽的多肽:i)由SEQxa0IDxa0NO:3所示的核苷酸序列编码的多肽;ii)由核苷酸序列编码的多肽,其中所述序列由于遗传密码而与(i)中定义的核苷酸序列简并;iii)由SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列组成的多肽;其中所述组合物任选地包含佐剂和/或载体。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物适于以鼻腔喷雾的形式施用。
7.根据权利要求5或6所述的疫苗组合物,其中所述组合物包含至少一种额外的抗菌剂。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物,其中所述额外的抗菌剂是第二种不同的疫苗和/或免疫原性试剂。
9.根据权利要求1-3的任一项所述的多肽在制备治疗金黄色葡萄球菌感染或因金黄色葡萄球菌感染而引起的病况的药物中的用途。
10.根据权利要求4所述的核酸分子在制备治疗金黄色葡萄球菌感染或因金黄色葡萄球菌感染而引起的病况的药物中的用途。
11.根据权利要求9或10所述的用途,其中因金黄色葡萄球菌感染而引起的所述病况选自:细菌相关食物中毒、血液感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、皮肤病、髓膜炎、肺炎、脓毒性咽喉炎、坏死性筋膜炎、胃肠炎、和关节炎。
12.根据权利要求11所述的用途,其中所述血液感染为败血病。
13.根据权利要求11所述的用途,其中所述皮肤病为脓疱病。
14.根据权利要求9至13任一项所述的用途,其中在使用中被施用的受试者为人。
15.根据权利要求9至13任一项所述的用途,其中在使用中被施用的受试者为家畜动物。
16.根据权利要求15所述的用途,其中所述家畜动物为羊类动物。
17.根据权利要求15所述的用途,其中所述家畜动物为牛类动物。技术领域
本发明涉及抗原多肽、包含所述多肽的疫苗和所述疫苗在保护受试者免受微生物感染中的用途。
背景技术
疫苗保护免受许多感染性疾病的侵害。许多疫苗通过灭活或减毒的病原体产生,所述病原体可被注射进入受试者。经免疫的受试者通过产生体液(例如抗体)和细胞(例如细胞毒性T细胞)反应来作出反应。例如,某些流感疫苗通过利用使用甲醛的化学处理灭活病毒来进行制备。对于许多病原体,化学或热灭活(虽然其可产生赋予保护性免疫的疫苗免疫原)也产生副作用例如发热和注射部位反应。在细菌的情况下,灭活的生物体倾向于具有如此高的毒性以至于副作用限制了此类粗制疫苗免疫原(例如细胞百日咳菌苗(pertussisxa0vaccine))的应用,从而疫苗的开发已落后于药物开发。此外,使用完整细胞灭活的生物体的有效疫苗开发受到表位遮蔽(epitopexa0masking)、免疫显性、低抗原浓度和抗原冗余(antigenxa0redundancy)的问题困扰。这是不幸的,因为目前的抗生素治疗现因抗药性细菌的出现而受到偏见。因此,许多现代疫苗从病原体的保护性抗原(通过分子克隆分离的和从产生副作用的材料纯化的)制得。这类后一种疫苗称为‘亚单位疫苗’。亚单位疫苗的开发在近年来已成为许多研究的焦点。新型病原体的出现和抗生素抗药性的增加已产生了对开发新型疫苗和鉴定在亚单位疫苗的开发中是有用的其他候选分子的需要。同样地,从基因组和蛋白质组学研究发现新型疫苗抗原将使得能够开发新型亚单位疫苗候选者(特别是抗细菌病原体的)。然而,虽然亚单位疫苗倾向于避免被杀死的或减毒的病原体疫苗的副作用,但它们的“纯的”状态意味着亚单位疫苗并非总是具有足够的免疫原性来赋予保护作用。已产生对抗生素的抗性的病原生物的实例金黄色葡萄球菌(Staphylococcusxa0aureus)。金黄色葡萄球菌是其正常生长环境是约20-40%的正常健康人的鼻的上皮内层(epithelialxa0lining)的细菌,其也通常见于人的皮肤,通常不引起伤害。然而,在某些情况下,特别是当皮肤损伤时,该病原体可引起感染。这在医院中是个具体问题,其中患者可能已进行外科手术和/或正在服用免疫抑制药。这些患者因它们已接受的治疗而更容易遭受金黄色葡萄球菌感染。由于抗金黄色葡萄球菌抗生素被广泛用于控制微生物感染,因此金黄色葡萄球菌的抗抗生素菌株已出现。抗甲氧西林菌株非常普遍并且这些抗性菌株中有许多也抗几种其他抗生素。目前还没有针对金黄色葡萄球菌的有效接种方法。因此金黄色葡萄球菌是主要的人病原体,其能够引起许多疾病,其中一些疾病是威胁生命的疾病,包括败血病、心内膜炎、关节炎和中毒性休克。该能力通过生物体的多样性和其参与毒性的组分库(arsenalxa0ofxa0component)来确定。在感染开始时,和随着其进展,生物体的需要和环境改变,这反映在金黄色葡萄球菌产生的毒力决定簇的相应改变。在感染开始时,对于病原体重要的是附着于宿主组织,这样才能产生一大套细胞表面相关附着蛋白(cellxa0surfacexa0associatedxa0attachmentxa0protein)。病原体还具有通过产生因子逃避宿主防御的能力,所述因子可减少吞噬作用或干扰细胞被循环抗体识别的能力。通常感染的病灶发展为脓肿并且生物体的数量增加。金黄色葡萄球菌具有通过产生群感效应肽(quorumxa0sensingxa0peptide)监控其自己的细胞密度的能力。该肽的积累(与通过开始饥饿细胞造成的生理变化相关)在毒力决定簇的产生上引发从粘附素(adhesin)至参与侵袭和组织穿透的成分的转换。
发明内容
本公开内容涉及从革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离和表征的抗原多肽DivIB的鉴定。DivIB是膜内在蛋白质,其包含细胞内结构域[氨基酸1-171]和膜间结构域[氨基酸172-192]以及细胞外结构域[氨基酸193-439]。这在图1中进行了示意性举例说明。已显示DivIB和其片段提供了免受金黄色葡萄球菌攻击的保护作用并且代表了新型疫苗候选者。革兰阴性细菌中的DivIB同源物称为FtsQ。根据本发明的方面,提供了选自下列多肽的多肽:i)由图2a、3a或4a中所示的核苷酸序列编码的多肽或其抗原片段;ii)由核苷酸序列编码的多肽,其中所述序列由于遗传密码而与(i)中定义的核苷酸序列简并;iii)包含氨基酸序列的多肽,其中通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰所述序列,如图2b、3b或4b中所示,其中所述多肽用作疫苗。经修饰的多肽或变异多肽在氨基酸序列方面的不同在于可以通过可存在于任何组合的一个或多个替代、添加、缺失、截短。其中优选变体是与参照多肽不同在于保守氨基酸替代的那些变体。此类替代是用另一个具有相似特征的氨基酸替代给定氨基酸的那些替代。氨基酸的下列非限定性列表被认为是保守替代(相似):a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸;b)谷氨酸和天冬氨酸;c)天冬酰胺和谷氨酰胺;d)精氨酸和赖氨酸;e)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是保持或增强与其所源自的参照多肽相同的生物功能和活性的变体。在一个实施方案中,变异多肽与本文中举例说明的全长氨基酸序列具有至少85%的同一性,更优选至少90%的同一性,更优选至少95%的同一性,仍然更优选至少97%的同一性和最优选至少99%的同一性。在本发明的优选实施方案中,所述多肽由图2a中所示的核苷酸序列编码。在本发明的可选择的优选实施方案中,所述多肽由图2b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。在本发明的优选实施方案中,所述多肽由图3a中所示的核苷酸序列编码。在本发明的可选择的优选实施方案中,所述多肽由图3b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。在本发明的优选实施方案中,所述多肽由图4a中所示的核苷酸序列编码。在本发明的可选择的优选实施方案中,所述多肽由图4b中的氨基酸序列或其抗原性部分表示。根据本发明的其他方面,提供了编码用作疫苗的根据本发明的多肽的核酸分子。根据本发明的其他方面,提供了用于抗微生物感染而接种的疫苗组合物,其包含选自下列多肽的多肽:i)由图2a、3a或4a中所示的核苷酸序列编码的多肽或其抗原片段;ii)由核苷酸序列编码的多肽,其中所述序列由于遗传密码而与(i)中定义的核苷酸序列简并;iii)包含氨基酸序列的多肽,其中通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰所述序列,如图2b、3b或4b中所示;其中所述组合物任选地包含佐剂和/或载体。在本发明的优选实施方案中,所述组合物包含佐剂和/或载体。在本发明的优选实施方案中,所述佐剂选自:选自GMCSF、干扰素γ、干扰素α、干扰素β、白细胞介素12、白细胞介素23、白细胞介素17、白细胞介素2、白细胞介素1、TGF、TNFα和TNFβ的细胞因子。在本发明的其他可选择的实施方案中,所述佐剂为TLR激动剂例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰脂质A、聚肌胞(polyxa0I:C)及其衍生物。在本发明的优选实施方案中,所述佐剂为细菌细胞壁衍生物例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖dicorynomycolate(TDM)。佐剂是通过调节免疫细胞的活性增强对抗原的特异性免疫反应的物质或方法。佐剂的实例包括(仅通过举例)针对共刺激分子的激动性抗体、弗氏佐剂、胞壁酰二肽、脂质体。因此佐剂是免疫调节剂。载体是免疫原性分子,当其与第二分子结合时,增强对后者的免疫反应。以下列方式解释术语载体。载体是当与第二分子结合时增强对后者的免疫反应的免疫原性分子。某些抗原本质上不具有免疫原性,然而当与外源蛋白质分子例如钥孔血蓝蛋白(keyhole-limpetxa0haemocyanin)或破伤风类毒素结合时可以能够产生抗体反应。此类抗原包含B细胞表位但无T细胞表位。这样的缀合物的蛋白质部分(所述“载体”蛋白)提供了刺激辅助T细胞的T细胞表位,这转而刺激抗原特异性B细胞分化成浆细胞,并且产生抗所述抗原的抗体。在本发明的优选实施方案中,所述微生物感染是由选自下列的细菌种类引起的:葡萄球菌(Staphylococcusxa0spp)、粪肠球菌(Enterococcusxa0faecalis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumxa0tuberculosis)、B族链球菌(Streptococcusxa0groupxa0B)、肺炎链球菌(Streptococcusxa0pneumoniae)、幽门螺杆菌(Helicobacterxa0pylori)、淋病奈瑟球菌(Neisseriaxa0gonorrhoea)、A族链球菌(Streptococcusxa0groupxa0A)、伯氏疏螺旋体(Borreliaxa0burgdorferi)、粗球孢子菌(Coccidiodesxa0immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmaxa0capsulatum)、爱氏克雷伯氏菌(Klebsiellaxa0edwardii)、B型脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriaxa0meningitidisxa0typexa0B)、奇异变形杆菌(Proteusxa0mirabilis)、弗氏志贺菌(Shigellaxa0flexneri)、大肠杆菌(Escherichiaxa0coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusxa0influenzae)、沙眼衣原体(Chlamydiaxa0trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydiaxa0pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiaxa0psittaci)、土拉热弗朗西丝菌(Francisellaxa0tularensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasxa0aeruginosa)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusxa0anthracis)、肉毒梭菌(Clostridiumxa0botulinum)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniaxa0pestis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaxa0mallei)或类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)。在本发明的优选实施方案中,所述细菌种类选自:表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌(S.hominis)溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、头状葡萄球菌(S.capitis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、孔氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、中间葡萄球菌(S.intermedius)。在本发明的其他优选实施方案中,所述葡萄球菌属细胞为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。本发明的疫苗组合物可通过任何常规途径来施用,包括注射、鼻内喷雾(通过例如气溶胶或滴鼻剂的吸入)。施用可以是例如静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下或皮内l施用。以有效量施用本发明的疫苗组合物。“有效量”是单独或与其他剂量一起产生期望反应的疫苗组合物的量。在治疗特定细菌性疾病的情况下,期望的反应是当被传染源攻击时提供保护作用。在本发明的优选实施方案中,所述疫苗组合物适于以鼻腔喷雾的形式施用。在本发明的优选实施方案中,所述疫苗组合物提供于吸入器中并且以气溶胶形式递送。疫苗的量当然将取决于个体患者参数,包括年龄、身体健康状况、身材大小和体重、治疗持续时间、当前治疗的性质(如果存在的话)、具体的施用途径以及在保健人员的知识和专家经验内的类似因素。这些因素对于本领域技术人员来说是公知的并且仅用常规实验即可阐明。通常优选的是,使用足以激发免疫的最大剂量的单种组分或其组合;即,根据可靠的医学判断的最高安全剂量。然而,本领域技术人员应理解,患者可因医学原因、心理原因或因实际上任何其他原因支持更低剂量或可耐受剂量。可根据不同参数,特别是根据所使用的施用模式和受试者的状态来选择给受试者施用的疫苗剂量。在受试者的反应在所施用的初始剂量上不足的情况下,可使用更高的剂量(或通过不同的更局部的递送途径产生的实际上更高的剂量),达到患者的耐受力所允许的程度。一般而言,按照本领域任何标准方法以有效免疫的剂量配制和施用疫苗的剂量。用于施用疫苗组合物的其他方案对于本领域技术人员来说是已知的,其中剂量、注射时间安排、注射部位、施用模式等与上述的不同。在与上述条件大体上相同的条件下给除了人之外的哺乳动物施用疫苗组合物(例如为了测试目的或兽医学治疗目的)。本文中所使用的受试者是哺乳动物,优选人,并且包括非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊或山羊。在本发明的优选实施方案中,提供了根据本发明的疫苗组合物,其包含至少一种额外的抗菌剂。在本发明的优选实施方案中,所述试剂是第二种不同的疫苗和/或免疫原性试剂(例如细菌多肽和/或多糖抗原)。根据本发明的其他方面,提供了本文中描述的用于治疗微生物感染或因微生物感染而引起的病况的多肽。在本发明的优选实施方案中,所述微生物感染是葡萄球菌性感染。在本发明的优选实施方案中,因微生物感染引起的所述病况选自:结核病、细菌相关食物中毒、血液感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、败血病、皮肤病、髓膜炎(meningitis)、肺炎、胃溃疡、淋病、脓毒性咽喉炎、链球菌相关中毒性休克、坏死性筋膜炎、脓疱病、组织胞浆菌病、莱姆病、胃肠炎、痢疾、志贺菌病(Shigellosis)和关节炎。根据本发明的其它方面,提供了免疫受试者的方法,包括用有效量的根据本发明的多肽、核酸分子或疫苗组合物接种所述受试者。在本发明的优选方法中,所述受试者是人。在本发明的可选择的优选方法中,所述受试者是动物,优选家畜动物,例如牛。在本发明的优选方法中,给所述家畜动物接种抗由葡萄球菌属细菌细胞引起的细菌性乳腺炎的疫苗。在本发明的优选方法中,所述家畜动物是羊类(caprine)动物(例如绵羊、山羊)。在本发明的优选方法中,所述家畜动物是牛类动物(例如,奶牛)。葡萄球菌性乳腺炎是影响家畜的严重病况并且在通过施用抗生素来控制疾病方面和在损失奶产量方面可造成相当大的开支。根据本发明的疫苗提供了对细菌性(特别是葡萄球菌性)乳腺炎的成本效益高的控制。在本说明书的整个描述和权利要求中,词汇“包括”和“包含”以及所述词汇的变型例如“含有”和“包括”意指“包括但不限于”,并且无意(和不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求中,除非上下文另外要求,否则单数包括复数形式。特别地,当使用不定冠词时,除非上下文另有要求,否则说明书应被理解为包括复数以及单数。与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合起来描述的特性、整数、特征、化合物、化学部分或基团应被理解为除非与其不相容,否则适用于本文中描述的任何其他方面、实施方案或实施例。
附图说明
现仅通过举例和参考下列附图来描述本发明的实施方案:图1DivIB蛋白被预测为具有指定的主要模型拓扑分布的膜蛋白。所述蛋白的N末端(氨基酸1至171)位于细胞内,然而所述蛋白的C末端(氨基酸193至439)暴露于膜的外部;预测的金黄色葡萄球菌DivIB的外部分(氨基酸193至439)对应于称为DivIB-1的片段;图2a举例说明来自金黄色葡萄球菌8325的全长DivIB核苷酸序列;图2b举例说明来自金黄色葡萄球菌8325的氨基酸序列,该序列对应于GeneBankxa0ID号ABD30258.1;图3a举例说明包括氨基酸193至439的金黄色葡萄球菌DivIB的膜外片段(DiviB-1)的核苷酸序列,图3b举例说明其氨基酸序列;图4a举例说明DivIB-2的核苷酸序列,图4b举例说明其氨基酸序列;和图5和图6举例说明由DivIB-2接种赋予的抗感染保护作用。
具体实施方式
方法和材料用于在大肠杆菌中过表达来自金属色葡萄球菌的DivIB-1片段的质粒的构建使用引物5’GLUSh341C和3’GLUSh341C(分别对应于序列引物1和引物2)和下列PCR反应条件从菌株金黄色葡萄菌SH1000(Horsburghxa0MJ,Aishxa0JL,Whitexa0IJ,Shawxa0L,Lithgowxa0JK,Fosterxa0SJ:sigmaBxa0modulatesxa0virulencexa0determinantxa0expressionxa0andxa0stressxa0resistance:characterizationxa0ofxa0axa0functionalxa0rsbUxa0strainxa0derivedxa0fromxa0Staphylococcusxa0aureus8325-4.Jxa0Bacteriol2002,184:5457-5467)的染色体PCR扩增片段DivIB-1:1个起始变性循环:94°C下进行4分钟;30个扩增循环:在94°C下变性30秒,在45°C下退火30秒以及在72°C下延伸2.5秒;最后,使持续扩增轮在72°C下进行4分钟来完成。分别在引物5’GLUSh341C和3’GLUSh341C内工程化两个限制位点NcoI和XhoI(序列中加下划线的)。将用NcoI和XhoI消化的片段DivIB-1克隆进入来自Novagen的pET-21d(+)(Cat.No.69743-3)的NcoI和XhoI位点,导致称为pGL601的过表达质粒,从而产生DivIB-1片段的6xHis标记的形式。将后者转移进入大肠杆菌BL21以过表达所述重组蛋白片段。引物1(5’GLUSh341C)ATAATACCATGGCTCCACTTAGTAAAATTGCGCATG引物2(3’GLUSh341C)ATAATACTCGAGATTATTCTTACTTGATTGTTTG将上文所示的PCR扩增片段在NcoI和XhoI位点克隆进入受体pET21d(+)受体质粒载体使得在DivIB-1序列的上游添加了两个氨基酸(甲硫氨酸和丙氨酸)和在DivIB-1序列的下游添加了8个氨基酸(亮氨酸、谷氨酸和6个组氨酸)。该整个区域包括待从ATG翻译起始密码子至TGA翻译终止密码子(在序列内以粗体标示的)产生的蛋白质片段,其被称为DivIB-2。DivIB-2的DNA(图4a)和蛋白质(图4b)序列示于下面并且DivIB-1片段的增补核苷酸以下划线标示。实施例利用DivIB-2的接种保护Balb/C小鼠免受金黄色葡萄球菌感染在每一个实验中,按照下列方案用DivIB-2接种一组10只6至12周龄的雌性Balb/C。用100微升由50微克在50微升无内毒素PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)中的重组DivIB-2(约98%的纯度)和50微升完全弗氏佐剂的混合物组成的溶液使每一只动物接触抗原。两周后,用100微升由50微克在50微升无内毒素PBS中的重组DivIB-2(约98%的纯度)和50微升不完全弗氏佐剂的混合物组成的溶液对动物进行免疫加强。1周后,动物接受相同的加强。在每一个实验中,除了所述混合物包含商购可得的KLH蛋白(钥孔血蓝蛋白)而非DivIB-2重组蛋白外,按照相同的方案处理对照组的10只动物。在动物的颈后部皮内进行接触抗原和加强注射。第二次免疫加强后1周,通过静脉内(尾静脉)注射100微升无内毒素PBS(其含有1.1×10⁷(±0.3×10⁷)个金黄色葡萄球菌菌株Newman的细胞)来感染每一只动物。从在心脑浸液培养基(BHI)中生长至早期静止期的培养物制备后者,随后用相同体积的PBS将其洗涤3次。10至14天后,按照方案1颈椎脱位术处死动物。在无菌条件下从每一只动物取出成对的肾,将其在无菌PBS中匀浆化。在PBS中进行肾匀浆物的系列稀释,将其涂布在BHI琼脂平板上。计数包含10至150个葡萄球菌菌落的平板,并且校正稀释度。从平板上菌落形成单位(CFU)的数目推知肾中的活细胞数目。根据利用KLH接种的动物的肾中金黄色葡萄球菌细胞的数目与利用DivIB-2接种的动物的肾中金黄色葡萄球菌细胞的数目的差异来测定通过用DivIB-2接种所赋予的可能的抗感染保护作用的评估。使用Mann-Whitney检验计算差异的统计学显著性。从与DivIB-2接种的动物相比较KLH接种的动物中显著更多的(p<0.05)数量的金黄色葡萄球菌得出保护作用的结论。上述的举例说明通过DivIB-2接种所赋予的抗感染的保护作用的的实验实例示于图5和图6中。显示了每一组的平均值和对照与所接种的组之间的统计上显著的差异。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="370"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="350"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="305"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="367"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="350"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="350"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="325"/>